摘要 

检验或活化霉菌及酵母菌常使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar, PDA)，因为PDA含有 丰富碳素源及氮素源，一些乳酸菌亦可于此培养基上生长，用于检测含活性乳酸菌食品时易导致伪阳性的 产生而误判检测结果。本研究以酸液调整PDA之pH值使乳酸菌在酸化PDA中不生长，而维持霉菌及酵母 菌之生长活性。研究结果显示在pH 2.5~3.5环境下，乳酸菌在PDA无法生长，但霉菌及酵母菌不受低pH 环境影响，因此吾等认为利用酸化PDA检测乳酸菌食品中的霉菌及酵母菌将更为准确。

关键词：食品微生物检验、乳酸菌、霉菌及酵母菌、酸化PDA

前言
台湾保健食品市场规模随着我国健康意 识提升而成长，2017年通过审查的保健食品 前五大功效要求为调节血脂、胃肠功能改善、 免疫调节、护肝、骨质保健[1]。根据国内外 研究显示乳酸菌有改善肠道菌相、增强免疫 功能、降胆固醇、降血脂或减少体脂肪形成 等功效，食品中常以乳酸菌做为益生菌原料。 随着国人生活水平上升，对于食品卫生要求 愈发严格。检测方法进行含乳酸活菌产品时， 若是以PDA为检测培养基，检测结果容易因 乳酸活菌生长于PDA中而有伪阳性。目前市 面上已有多种乳酸活菌产品，然而检验乳酸 活菌产品中霉菌及酵母菌时，因乳酸活菌能 生长于PDA上，导致不易判断产品是否被霉 菌或酵母菌所污染。文献指出酸可抑制乳酸
菌生长[2]，而霉菌及酵母菌耐酸性较佳[3]， 因此本研究欲以酸液调整PDA之 pH值，在 不影响霉菌及酵母菌生长的前提下，使乳酸 活菌不生长于PDA上。
材料与方法
培养基、试剂 BD DifcoTM Potato Dextrose Broth（马 铃薯葡萄糖培养基；PDB）、BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth（乳酸杆菌 MRS 培 养基）、BD DifcoTM Agar（洋菜）皆购买自 启新生物科技有限公司，新北市。盐酸(HCl) 购自Sigma-Aldrich（德国）、85%磷酸(H3PO3) 购自第一化工原料股份有限公司（台湾）、 柠檬酸(Cirtric acid)购自三福化工股份有限 公司（中国）、苹果酸(Malic acid)购自国华 贸易股份有限公司（日本）。
10%(w/w)酸液制备 将 37%盐酸、85%磷酸、柠檬酸粉末、 苹果酸粉末分别加入无菌水中混匀至浓度为
10%(w/w)，以0.22 m filter 过滤至无菌离 心管内备用。
实验菌种 Lactobacillus plantarum (BCRC 10069)、 Lactococcus lactis (BCRC 12312)、Lactobacillus rhamnosus (BCRC 16000)、Lactobacillus paracasei (BCRC 16100)、Pediococcus pentosaceus (BCRC 10068)、Aspergillus oryzae (BCRC 30289)、Saccharomyces cerevisiae (BCRC 21800)以上菌株皆购自财团法人食品 工业发展研究所生资中心（新竹，台湾）。
菌株活化 乳酸菌菌液制备 : 将乳酸菌冷冻保存管 以无菌接种环沾取至Lactobacilli MRS平板 进行四区划线，倒置37℃于厌氧环境培养 48±2小时，培养完毕再将单一菌落以无菌接 种环沾取至Lactobacilli MRS Broth中，37℃ 于厌氧环境培养16~18小时。 真菌菌液制备 : 将霉菌或酵母菌之纯菌 冷冻保存管以无菌接种环进行四区划线接种 至PDA平板，正放25℃培养5-7天，活化后 真菌平板以无菌接种环取单一菌落接种至 PDB，培养于25℃培养5-7天备用。
酸化马铃薯葡萄糖洋菜培养基（酸化 PDA） 制备 将 PDB 粉末加入总体积2% Agar，以 121℃高温高压灭菌15分钟，冷却至45-50℃， 加入先前制备好之酸液由pH 5.1调整pH至 3.8、3.5、3.0与 2.5。 酸化 PDA 配制方法经预实验结果如表 1，不同酸液调整至pH 3.8 (±0.1)使用酸液量 不同。 由 HCl配制酸化PDA调整至不同pH值 使用酸量如表2。

乳酸菌数检测 利用倾注平板法进行乳酸菌数计数，操 作方法如下：取乳酸活菌菌液1 mL以 1% peptone water 进行序列稀释，稀释至10-6、 10-7，各稀释液分别取1mL 至无菌培养皿， 再倒入15~20 mL经灭菌完成冷却至45-50℃ 之Lactobacilli MRS agar，执行平板两重复， 待平板冷却凝固后倒置培养于37℃厌氧环境 48 ± 2小时，培养后计数平板上的单一菌落， 菌落计数范围介于25~250 CFU 之间，两平 板菌落数平均后得实验结果。
霉菌与酵母菌检测 利用倾注法进行真菌活性检测，操作方 法如下：将活化好之真菌菌液，经培养后以 倾注平板法培养于PDA 于 25℃培养5-7天， 观察生长活性状况。
乳酸菌于PDA上生长活性测试 同上述乳酸菌检测方式，将乳酸菌以倾 注平板法检测，培养条件比照霉菌与酵母菌， 培养基使用PDA取代Lactobacilli MRS agar， 倒置培养于25℃培养5-7天，培养后计数平 板上的单一菌落，菌落计数范围介于25~250 CFU之间，两平板菌落数平均后得实验结果。
酸性PDA对于乳酸菌与真菌生长活性测试 乳酸菌实验方法同上述乳酸菌于PDA上 生长活性测试，使用培养基为酸化PDA，倒 置培养于25℃培养5-7天，培养后计数平板 上的单一菌落，菌落计数范围介于25~250 CFU之间，两平板菌落数平均后得实验结果。 霉菌与酵母菌实验方法同上述霉菌与酵 母菌检测，将霉菌、酵母菌以倾注法于各酸 化PDA，正放于25℃培养5-7天，经培养后 观察菌落型态生长活性状况。
结果
为评估乳酸菌于PDA之生长状况，本研 究将乳酸菌活化后经序列稀释至适当稀释倍 数后以倾注培养于MRSA及PDA，结果如表 3 所示，乳酸菌以倾注平板法接种于 MRS agar 及 PDA，乳酸菌于两种培养基皆可生 长，并且其菌落数目无明显差异。乳酸菌于 MRSA培养基上生长活性较佳，菌落呈白色 明显肉眼可见，但由于PDA是霉菌与酵母菌 通用培养基，乳酸活菌虽然可以生长于此培 养基上，但对于部分乳酸菌较为不适，而生 长出的乳酸菌菌落形态会偏细小，较不易计 数。 藉由不同酸液调整至 pH 3.8之 PDA 确 认乳酸菌于一般酸化PDA生长活性。由表4 结果显示部分乳酸菌由调整至pH 3.8 PDA倾 注培养几乎没有活性，但是 Lactobacillus plantarum 较为耐酸，活性较强，于 pH 3.8 之 PDA中菌数与MRS agar中菌数无明显差 异。 以不同酸液调整pH值之PDA皆可抑制 大部份乳酸菌的生长（表4）。以此结果可 推断以调整 pH 方式可以抑制乳酸菌生长活 性，以 pH 值 3.8之 PDA 虽然可降低大部分 乳酸菌活性，但还是有耐酸特性较强的乳酸 菌无法被抑制，故以 pH 3.8之酸化 PDA 不 足以客观表现乳酸活菌产品之卫生检测结果。

根据表4 结果显示，由各种酸液调整pH 之PDA对于L. plantarum生长活性无显著差 异，为了改进此缺点，后续实验使用实验室 内最常见之酸液（盐酸）制备酸化PDA，再 由上述实验结果改良实验方法，以10% 盐酸 酸液调整 PDA 之 pH，由原始 pH5.1调整至 pH 3.5、3.0、2.5。各乳酸菌接种至 MRS Broth 37℃培养16~18小时，再以MRS agar 倾注培养37℃2-3天，同时以不同pH之PDA 倾注培养25℃5-7天，培养后观察结果如表 5。将活性乳酸菌倾注培养于 pH 3.5、3.0、 2.5之 PDA 中，各乳酸菌皆无法生长，证明 降低pH值可以抑制乳酸菌活性。 为了确认真菌生长活性不受高酸性环境 影响，本研究将霉菌与酵母菌以倾注法培养 于不同 pH 之 PDA 平板，再以25℃培养5-7 天，观察其生长情形，结果如图1、图2 所 示，代表霉菌的Aspergillus oryzae与代表酵 母菌的 Saccharomyces cerevisiae 皆可于低 pH之PDA平板生长，由此可知低pH 之PDA 霉菌与酵母菌亦可生长，观察酸化PDA平板 生长之菌落型态与未调整pH之 PDA并无差 异，生长活性亦无明显差别，将PDA酸化可 大幅降低乳酸菌在PDA中检出机率，且不影 响霉菌与酵母菌检测，进而降低检测报告之 伪阳性。

讨论
依据本研究结果乳酸菌于PDA上生长活 性测试结果证明乳酸活菌可被PDA检出来。 若以无经处理之PDA检测含活性乳酸菌之产 品，检测结果可能会有伪阳性，进而影响品 管检验判定。为使品管检验更加准确，必须 开发抑制乳酸菌于PDA之生长活性方法。本 研究以一般酸化PDA (pH 3.8)确实可抑制乳 酸菌生长活性，但有部分乳酸菌耐酸度较强， pH 3.8亦可生长。由此可知酸化是一个有效 且可行的方法，但需再作改善，经由再降低 pH至 3.5-2.5的PDA确实能有效抑制乳酸菌 活性，且不影响霉菌与酵母菌生长活性，因 此，将PDA酸化至pH 3.5-2.5范围内后再检 验含乳酸活菌产品，可以使卫生检验结果降
低其伪阳性而更加准确。本研究使用一株酵 母及一株霉菌做为测试基准，未来将进一步 测试多种真菌于酸化PDA生长情形，以确认 酸化PDA检验适用性。
参考文献
1. 食品工业发展研究所。2018 食品产业年鉴。 2018.08.08。食品工业发展研究所。台湾。 2. 林志勋。有机酸和乳酸菌之相互关系。现代养猪。 2011; 32:18-20。台湾动物科技研究所， 台湾。 3. 王凤梅，马里兵。内蒙古西部地区本土葡萄酒酿酒 酵母发酵特性研究。2015; 31:204-8，生物技术通报。 中国。 4. 卫生福利部食品药物管理署。食品微生物之检验方 法－霉菌及酵母菌数之检验。2013。2013.09.06部授 食字第 1021950329 号公告修正。行政院卫生福利 部，台湾。