前言

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 及其肠毒素可经由食品媒介引起肠胃炎，为 食物中毒的主要致病原之一[1, 2]。中国大陆国 家标准金黄色葡萄球菌检验公告方法[3]建议 使用血琼脂平板（BAP，以TSA或Columbia agar为基础培养基）作为分离培养基。另外， 临床微生物检验室常用TSA所配制的BAP接 种临床检体[4]，以便初步识别不同溶血型式的分离菌。

此两种检验室之所以使用BAP， 系因为可利用此菌在BAP的 溶血性( -hemolysis)作为生长菌落的识别[3, 4]，BAP上菌落 的 溶血性系因为其中的红血球被能够产生溶 血素(hemolysin)的S. aureus所分解而破裂， 造成溶血现象，因此，菌落周围将呈现环状 透明[4]。 由于BAP配制所使用的基础培养基因应 用对象不同而异，并且同种类菌不同菌株在 含有不同基础培养基BAP的溶血能力是否相 同，将是临床检验室或食品厂品管室检验人 员极欲了解的问题，目前，用于配制BAP的 基础培养基种类包括 Tryptic Soy Agar-II

(TSA-II)、Columbia Agar、Brucella Agar以 及brain heart infusion agar (BHIA)，配制后 倒平板前，再添加5~10%绵羊血。其中，含 TSA-II的BAP用于培养一般常见的细菌及酵 母菌，含Columbia Agar的BAP用于培养嗜 氧性与兼性厌氧菌以及绝对厌氧菌，含Brucella Agar之BAP用于分离厌氧菌，而BHIA 则常用于分离真菌[5]。 在检验室，不同链球菌常利用其生长菌 落在BAP呈现的溶血型做为菌种或不同血清 群的初步鉴定依据[6]，一般 溶血型B群链球 菌(Group B streptococci，GBS)在 BAP的生 长菌落具有溶血性，但占约3~5%的 溶血型 B 群链球菌却无法在BAP呈现明显溶血性[7, 8]，因此，需要含有溶血加强剂才能诱导不 溶血的 GBS 菌落产生 溶血，否则易导致其 漏检[9]。由于临床上S. aureus亦可能出现侏 儒变异株(dwarf variant)，其对营养需求较 高，在BAP上常形成微小的菌落，而且通常 不具 -溶血型[10, 11]。有鉴于此，本研究以添 加与不添加溶血加强液至含不同基础培养基 (TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 与 BHIA)之BAP探讨是否会对S. aureus ATCC 25923与 ATCC 6538溶血能力产生影响。
材料与方法
菌株制备 本研究使用 S. aureus ATCC 25923与 ATCC 6538作为培养基生长效能测试的标准 菌株，菌株保存于-70℃，研究操作前，将上 述菌株移种至 BAP（启新生物科技有限公 司，新北市），培养于35±1℃培养箱中18~24 小时，共接种两次以活化菌株。之所以选择 此两种菌株做为研究对象，系因ATCC 25923 为临床[4]以及中国大陆国标食品微生物学检 验：金黄色葡萄球菌检验建议的标准菌株[3]， 而 ATCC 6538则为美国药典[12, 13]及中华药 典[14, 15]之无菌试验法及非无菌产品中之特定微生物检验法建议的标准菌株。S. aureus ATCC 25923菌落在BAP上的菌落颜色为白 色，形状为圆形、凸起典型菌落，而 ATCC 6538菌落颜色则为黄色，亦呈圆形、凸起， 两种菌株的菌落大小相近。
培养基 本研究使用的各种基础培养基均添加5% 绵羊血而制成 BAP，基础培养基包含：(i) TSA-II、TSA-II+（TSA与 TSA-II+分别代表 未添加及添加溶血加强液之BAP）；(ii) Columbia agar、Columbia agar+（Columbia agar、 Columbia agar+分别代表未添加及添加溶血 加强液之BAP）；(iii) Brucella agar、Brucella agar+ (Brucella agar、Brucella agar+分别代 表未添加及添加溶血加强液之 BAP)；(iv) BHIA、BHIA+（BHIA与 BHIA+代表未添加 及添加溶血加强液之BAP），这些含有各种 基础培养基的BAP均购自启新生物科技有限 公司（新北市，台湾）。
测试菌悬浮液的制备 首先将新鲜生长S. aureus两种菌株的生 长菌落分别以接种环挑取，然后移种至5 mL Tryptic Soy Broth (TSB)中，悬浮液调整至相 当于McFarland No. 0.5的标准浓度，并以分 光亮度机测量调整其optic density (O.D.)值至 0.08~0.1之间，此时菌数约为1.5×108 CFU/ mL，接着进行十倍序列稀释5次至约103 CFU/ mL后，然后进行各种BAP的溶血试验。
溶血性试验 以微量吸管分别吸取两种菌株的菌液0.1 mL 单独地加至 TSA-II、TSA-II+、Columbia agar、Columbia agar+、Brucella agar、Brucella agar+、BHIA 与 BHIA+ 所配制的 BAP，再以 无菌玻棒均匀涂抹，操作二重复。将所有接 种的BAP倒置培养于35±1℃培养箱，24±2小时后观察所有BAP上生长菌落大小、溶血圈 大小，并进行菌落计数，然后比较未添加与 添加溶血加强液对两菌株生长菌落溶血圈大 小的影响。以游标尺测量5 个单一菌落溶血 圈大小(cm)后加以平均，且计算标准偏差。本 研究以TSA-II血平板溶血圈大小作为对照组 (100%)比较两种菌株在各种BAP的溶血能力。

结果
测试 S. aureus ATCC 25923与 ATCC 6538两菌株在各个BAP (TSA-II、TSA-II+、 Columbia agar、Columbia agar+、Brucella agar、Brucella agar+、BHIA与 BHIA+)的菌 落数，选择可计数的25~100 CFU 范围，这 些BAP的平均菌落数落差都在30% 以内（图 1），此指出两菌株在各种 BAP 的生长效能 差别甚少[16]，且各个BAP上生长菌落的大小 相近，并不受基础培养基的成分差异与溶血 加强液添加与否的影响，但溶血圈大小却受 到菌株种类与基础培养基成分的影响。 ATCC 25923 在含 TSA-II，TSA-II+， Brucellla agar与 Brucella agar+ 的 BAP与对 照组TSA-II溶血圈大小相近，而Columbia+ 的溶血圈虽然大于Columbia者，但与对照组 TSA-II比较，还是较小。另外，结果指出此 菌株在BHIA+上生长菌落的溶血能力最差， 此指出加入溶血加强液，反而会抑制此测试 菌株的溶血能力。（表1） ATCC 6538在含Columbia+与 Brucellla agar的 BAP与对照组含TSA-II的 BAP上生 长菌落的溶血圈大小无太大差异，然而，在 含 BHI与 BHI+者比含TSA-II的 BAP对照组 减少约25%，且溶血圈被抑制更为明显，尤 其是添加溶血加强液者更为显著。（表1）
讨论
S. aureus因含有溶血素（ 、 、 、 毒 素）而可溶血红血球，因此在BAP上的生长菌落具有完全( -)溶血性质，此特性可作为 初步鉴别此菌的依据之一[3, 4]，因此，BAP 上生长菌落所显现的溶血性直接影响检验人 员的判读，由于S. aureus为临床感染及食品 中毒常见的病原菌之一，因此，更需要依据 溶血圈作为初步鉴别。台湾卫福部食药署食 品金黄色葡萄球菌之检验，只建议使用BP培 养基(Baird-Parker medium)平板[17]，而中国 大陆国标方法则建议使用BAP 与 BP平板作 为初步分离食品检体中的S. aureus[3]。 本研究计算BAP上生长菌落溶血圈大小 时，皆选择菌落数25~100 CFU/平板的单一 菌落作为量测目标，此系为了避免生长菌落 过多，溶血圈互相干扰而影响其等的量测。 从 BAP 的基础培养基成分分析， TSA-II、 Columbia agar、Brucella agar都含有胰消化 蛋白胨(pancreatic digest of casein)作为氮素 源，氯化钠作为细菌生长环境酸碱变化的缓 冲剂，并维持渗透压。其中，TSA-II额外添 加生长因子，Columbia agar添加牛浸心液与 玉米淀粉，而Brucella agar则含有亚硫酸氢 钠[5]。S. aureus虽然可在含BHI成分的BAP 上生长，但其溶血能力不佳，研究结果发现 测试的两种菌株在含BHIA与 BHIA+的 BAP 上溶血圈的大小都会下降，尤其是添加溶血 加强液者反而更会被抑制。另外，ATCC 6538 于添加溶血加强液之Columbia agar+ 上所出 现的溶血圈虽然比未添加者大些，但并不显 着。 虽然S. aureus有些菌株生长菌落的外观 属于侏儒变异株(dwarf variants)，通常菌落 微小，不产生溶血[9, 10]，是否可藉由溶血加 强液的添加至BAP加以识别，值得未来加以 探讨。 综合上述，吾等认为(i) 含TSA-II、Columbia agar、Brucella agar基础培养基的BAP 均可提供S. aureus生长菌落之明显 -溶血性 而有助于其鉴别。(ii) 添加溶血加强液对 S.aureus 生长菌落之溶血圈大小与未添加者间 并无差异。(iii) 以 BHIA与 BHIA+基础培养 基所配制的 BAP 不适用于 S. aureus 生长菌 落之鉴别，添加溶血加强液甚至会抑制此菌的溶血能力，因此，无论在食品或临床检验 上，只需用以 TSA-II、Columbia agar、 Brucella agar基础成分培养基配制的BAP进 行 S. aureus的分离及鉴别。

參考文獻

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