前言

B 群链球菌(Group B Streptococcus； GBS；Streptococcus agalactiae)为一种革兰 氏阳性球菌，常栖息于生殖泌尿道与肠胃道

的共生菌，通常带菌者不会出现症状，但因 新生儿抵抗力较低，容易透过母亲垂直感染， 是造成新生儿败血症之最大杀手；既使治愈 后依然会有约30%带有神经系统的后遗症， 例如：听力或是视力受损、学习与运动障碍 或是脑性麻痹等[1-2]。 

目前卫福部建议怀孕35-37周孕妇应进 行筛检，透过棉拭采检阴道及直肠末端后， 接着把拭子接种在 Carrot broth、Lim broth或 Trans-Vag broth 中，若种在 Carrot broth 中于35-37℃的 CO2 培养箱培养18-24小时 后，发现有胡萝卜色即可发出 GBS 阳性报 告，若无则再移种至其他平板培养基；而种 在Lim broth或Trans-Vag broth中于35-37℃ 的 CO2 培养箱培养18-24小时后，全部需划 种于平板培养基，并再于35-37℃的 CO2 培 养箱培养18-24小时后，若有疑似菌落再进 行鉴定试验后才可发出报告[3]。 检测GBS的流程中必需将检体增菌后再 移种，目的为增加GBS的分离率[4]，而在台 湾[2-4]及国外的研究[5]中有提及GBS的增菌培 养液可选用Carrot broth, Lim broth及 TransVag broth，而移种的培养基可选用 BAP、 CNA、CHROMagar StreptB及GBS DetectTM， 而在台湾则有新设计的分离培养基-CMPTM Carrot agar及 / GBS detection agar bi-plate [6-8]皆可以很方便地分离GBS。 Lim broth[5, 9]为含 colistin 及 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培养液，可抑制革兰氏 阴性杆菌的生长。也有研究报告显示[11]，检 体增菌后的GBS分离率优于未增菌者，原因 可能是抑制其他阴道/直肠菌群，但此增菌方 法须经过多次培养确认，将会延迟报告[10]。 Trans-Vag broth[5, 11]为含5%绵羊血、 gentamicin 及 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培养液，大致上与 Lim broth 相同只差使用 的抗生素种类不同与额外添加5%绵羊血。 Gentamicin 和nalidixic acid可抑制部分革兰 氏阴性菌，添加5%绵羊血目的为提供更佳的 营养分以增加GBS的生长。 CMPTM Carrot broth[5, 12]为一种液态增 菌/鉴别培养基，含 GBS 生长所需物质及抑 制其它非链球菌的抗生素，并含少量琼脂与 特殊养份促使 溶血型 GBS 显色，阳性反应 会产生胡萝卜色。先前研究报告指出， -GBS 在Carrot broth产生胡萝卜色具有100%的专 一性[13]，因此产色即可发出阳性报告[3]，可以减少再次移种所需的人力、物力。 虽然GBS在BAP的生长菌落大多呈 溶 血型（菌落周围完全溶血），但仍有约3-5% 的菌落呈 溶血型（不溶血）且在Carrot broth 中不显色，为能够确切检测出所有GBS，可 搭配使用GBS detection agar，相关研究报告 指出CMPTM / GBS detection agar及 Hardy GBS DetectTM会诱导 溶血型GBS呈现 溶血 型，将可提高 溶血型 GBS 侦测的灵敏度与 分离率[14-15]。 本研究比较目前GBS检测常用的三种增 菌培养液(Carrot broth, Lim broth 及 TransVag broth)的效能，除了测试此三种增增菌培 养液的侦测极限，也与三种常见产道栖息菌 混合接种，以了解GBS在侦测中可能受到的 干扰。
材料与方法
试验菌株 本研究选用的测试菌株包括五株标准菌 种，Streptococcus agalactiae (ATCC 12386)、 Streptococcus agalactiae (ATCC13813)，Enterococcusfaecalis(ATCC29212)，Staphylococcus aureus (ATCC 25923)与 Escherichia coli (ATCC 25922)。上述五种菌株皆保存在-70℃ 的 GermBank 菌种保存管（启新生物科技公 司，新北市），试验前取出接种在 BAP 于 35-37℃的CO2 培养箱培养18-24小时，共活 化两次。
增菌培养液、移种培养基与试剂 本研究使用的增菌培养液包含 CMPTM Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth， 以及移种培养基BAP与 CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar之 bi-plate和系列 稀释使用的Tryptic soy broth (TSB) 培养液， 皆由启新生物科技有限公司（新北市，台湾） 提供。

三种增菌培养液的侦测极限 分别将 与 -GBS用TSB调至McFarland no 0.5 (1.5×108 CFU/mL)，再进行10倍系 列稀释至103-10 CFU/mL，并各取0.1 mL分 别接种在CMPTM Carrot broth、Lim broth及 Trans-Vag broth中（实际接种菌量为102-100 CFU），接种完后，置于35-37℃的 CO2 培 养箱培养，18-24小时后观察每一增菌液的 颜色变化，再以四区及三区划线分别移种于 BAP与CMPTM Carrot agar及 / GBS detection agar之bi-plate，并于35-37℃的CO2 培养箱 培养18-24小时，观察菌落是否生长与是否 有胡萝卜色及溶血菌落的产生。
三种增菌培养液的干扰试验 依照上述实验得到GBS在各增菌培养液 中的侦测极限，再分别将Enterococcus faecalis (ATCC 29212)，Staphylococcus aureus (ATCC 25923)与 Escherichia coli (ATCC 25922)利 用TSB调至相当于McFarland no 0.5标准液， 并进行十倍系列稀释，将 与 -GBS固定菌量 104 CFU，和其余三种干扰菌分别以10:1、 1:1、1:10之比例混合，然后都取0.1 mL 分 别接种于CMPTM Carrot broth、Lim broth及 Trans-Vag broth 中，接种完后置于35-37℃ 的 CO2 培养箱培养18-24小时，待增菌后观 察每一增菌液的颜色变化，再以四区及三区 划线分别移种于BAP与 CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar 之 bi-plate，并于 35-37℃的CO2 培养箱培养18-24小时，观察 菌落是否生长与是否有胡萝卜色及溶血菌落 的产生。
结果 与 -GBS在三种增菌培养液的侦测极限 将 102-100 CFU的 与 -GBS分别接种在 Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth， 并于35-37℃的CO2 培养箱培养18-24小时后观察颜色变化，并接种在CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar 之 bi-plate，于 35-37℃的CO2 培养箱培养18-24小时后观察 培养基上的菌落颜色及形态。 -GBS： -GBS 于 Carrot broth 中在菌 量高于10 CFU 时皆产生胡萝卜色，侦测率 皆为100% (3/3)，不过若是菌量为1 CFU时 则没有显色，不过却在 CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar之 bi-plate中有其 中两片产生胡萝卜色菌落，侦测率降低为 66.7% (2/3)；在 Lim broth 中，当菌量高于 10 CFU时，侦测率为100% (3/3)，若是菌量 为 1 CFU时则降低为0% (0/3)；在Trans-Vag broth中，当菌量高于10 CFU时，侦测率为 100% (3/3)，若是菌量为1 CFU时则降低为 66.7% (2/3)。（表1） -GBS： -GBS 于 Carrot broth 中在菌 量高于10 CFU时的侦测率皆为100% (3/3)， 不过若是菌量为1 CFU时则降低为33.3% (1/3)；在Lim broth中，当菌量高于10 CFU 时，侦测率为66.7% (2/3)，若是菌量为1 CFU时则降低为0% (0/3)；在Trans-Vag broth 中，当菌量高于10 CFU时，侦测率为100% (3/3)，若是菌量为1 CFU时则降低为33.3% (1/3)。（表1）
与 -GBS在三种增菌培养液的干扰试验 本研究将Enterococcus faecalis，Staphylococcus aureus与Escherichia coli以 10:1、 1:1、1:10之比例分别与 与 -GBS 混合，并 接种在Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth 并于35-37℃的 CO2 培养箱培养18-24 小时后观察颜色变化，并接种在CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar 之 bi-plate， 并于35-37℃的CO2 培养箱培养18-24小时后 观察培养基上的菌落颜色及形态。 -GBS： -GBS 于 Carrot broth 中与其 他三种菌以三种比例混合培养后，其中，与S. aureus 与 E.coli 混合的三种比例皆100% (3/3)产生胡萝卜色，而与E. faecalis以 10:1 或是1:1混合也不会干扰到胡萝卜色产生， 不过若是 -GBS与E. faecalis以 1:10混合的 话则不产生胡萝卜色(0/3)，必需接种到CMP TM Carrot agar及 / GBS detection agar之 bi-plate后，才在其中一片培养基上发现胡萝 卜色的菌落(1/3)。此外， -GBS 于Lim broth 及Trans-Vag broth中与其他三种杂菌混合培 养之后，S. aureus与 E.coli也不会干扰到 GBS的侦测，侦测率为100% (3/3)，只有当 -GBS 与 E. faecalis 以 1:10混合才会影响到 其侦测的能力，侦测率分别为0% (0/3)及 66.7% (2/3)（表2）。 -GBS： -GBS 的实验结果与 -GBS 相 似，在Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth 中，S. aureus 与 E.coli 并不会干扰 GBS的侦测，只有 -GBS与 E. faecalis以 1: 10混合才会影响到其侦测的能力，侦测率分 别为33.3% (1/3)、0% (0/3)及 33.3% (1/3) （表2）。
讨论
GBS常用的三种增菌培养液CMPTM Carrot broth, Lim broth及Trans-Vag broth，在之前 的研究报告皆有指出可有效增加GBS生长， 有助于 GBS 在平板培养基上的分离率[4-5]。 此次研究比较三种增菌培养基的效能，结果 指出三种增菌培养液对于 -GBS都可以100% 侦测到10 CFU 以上的菌量，若是 -GBS 为 1 CFU 时，Carrot broth 及 Trans-Vag broth 依然有66.7%的侦测率，不过Lim broth则为 0%（表1）。先前研究指出，Carrot broth对 于 -GBS 具有100%产生胡萝卜色的专一性 [14]，而在本研究中观察到当 -GBS菌量为10 CFU 以上时，Carrot broth 皆可产生典型胡 萝卜色，不过在菌量为1 CFU 时，Carrot broth却不产色，需要移种至同样能使 -GBS
产生胡萝卜色的平板培养基后，才能鉴定 出 -GBS，这是由于当菌量过低时， -GBS 在 Carrot broth 内的分布不集中，因此即使 产色也无法轻易用肉眼观察，此时只能增长 培养时间或是移种到平板培养基进行二次增 菌才可以观测到 -GBS。启新生物科技公司 所研发的 CMPTM GBS TransCultSwab 也具 有产生胡萝卜色的能力，与 Carrot broth 不 同的地方在于CMPTM GBS本身即为采检管， 在 35-37℃保存时能实时增菌，也因为其为 半固态培养基，更能让检体内的GBS实时增 菌以及维持厌氧的环境，因此在临床上的应 用上比Carrot broth有更好的效能[16-19]。 对于 -GBS的侦测极限，Carrot broth及 Trans-Vag broth都可以100%的侦测到10 CFU 以上的菌量，若是菌量为1 CFU 时，只有 33.3%的侦测率。而Lim broth对于 -GBS的 侦测极限，当菌量为10 CFU时为66.7%，1 CFU时为0%，这可能是由于Lim broth中所 含的养分相对于其他两种增菌培养液较低， 因此Lim broth对于低菌量的增菌效果较差。 将Enterococcus faecalis，Staphylococcus aureus 与 Escherichia coli 以 10:1、1:1、1: 10之比例分别与 与 -GBS混合进行GBS的 干扰试验，经由三种增菌培养液培养后，结 果显示S. aureus与E. coli在任何比例下，均 不影响 与 -GBS的生长，是由于三种增菌液 中皆有添加特定的抗生素来抑制革兰氏阴性 菌，还有除了链球菌以外的革兰氏阳性菌。 不过针对 E. faecalis，当 E. faecalis 的菌量 高于 与 -GBS 10倍以上时，就会干扰GBS 的生长（表2），也间接影响 -GBS在Carrot broth中的产色。 综合上述研究结果，对GBS来说，CMP TM Carrot broth及 Trans-Vag broth 具有较相 近的增菌能力，而 Lim broth 相较于其他两 种增菌液，增菌能力显然地较为不足。其中 Carrot broth更具有产生胡萝卜色的效能，一旦产色即可判定为 -GBS，不需要再移种至 其他培养基，可以省下更多的人力、物力以 及时效[16-18]。本次研究所用的三种增菌液接 对于临床上的杂菌都具有一定的抑菌性，唯 一会造成影响的是 E. faecalis，不过由于 E. faecalis 在分类与结构上都与 GBS 相近，因 此目前难以在培养的阶段专一性地抑制E. faecalis.

參考文獻 1. 社團法人台灣醫事檢驗學會。孕婦 B 群鏈球菌流行 病學、培養檢體處理及常在菌形態特性介紹。http:// www.labmed.org.tw/Upfiles/Test_5A/20177191587.pdf。 2017。 2. 衛生福利部國民健康署。孕產B群鏈球菌篩檢。https:/ /www.hpa.gov.tw/Pages/List.aspx?nodeid=196。2017。

参考文献 1. 社团法人台湾医事检验学会。孕妇 B 群链球菌流行 病学、培养检体处理及常在菌形态特性介绍。http:// www.labmed.org.tw/Upfiles/Test_5A/20177191587.pdf。 2017。 2. 卫生福利部国民健康署。孕产B群链球菌筛检。https:/ /www.hpa.gov.tw/Pages/List.aspx?nodeid=196。2017。

3. 台湾医事检验学会。B群链球菌筛检训练课程。http:/ /www.labmed.org.tw/Upfiles/Test_5A/201571416844. pdf。2015。 4. Elsayed S, Gregson D, Church D. Comparison of direct selective versus nonselective agar media plus LIM broth enrichment for determination of group B streptococcus colonization status in pregnant women. Arch Pathol Lab Med 2003; 127:718-20. 5. Spellerberg B, Brandt C. Streptococcus. In Jorgensen JH, Pfaller MA, Carroll KC, Funke G, Landry ML, Richter SS, Warnock DW (eds). Manual of Clinical Microbiology. 11th ed., 2015:383-402. ASM press, Washington DC, USA. 6. 黄玉霞，蔡文城。评估生殖道定植菌在CMP GBS 运送增菌培养管不同培养环境的消长。检验及品保 杂志2018; 7:111-8。 7. 邱彦昕，黄玉君，洪晟峰，陈诗婷，沈慧珊，蔡岳 廷，蔡文城。快速筛检B 群链球菌之简易创新设计-CMP Group B Strep TranSwab。检验及品保杂志 2013; 2:49-59 8. 黄玉霞，蔡文城。常见生殖道定植菌在CMPTM GBS 运送增菌培养管中的消长评估。检验及品保杂志2017; 6:172-7. 9. Lim D, Morales W, Walsh A. Lim group B Strep Broth and coagglutination for rapid identification of group B streptococci in preterm pregnant women. J Clin Microbiol 1987; 25:452-3. 10. Kavitha P, Shrikala B, Suchitra M. Comparison of various culture methods for isolation of group B Streptococcus from intrapartum vaginal colonization. J Lab Physicians 2013; 5:42-5. 11. Church D, Baxter H, Lloyd T, Miller B, Elsayed S. Evaluation of Strep B Carrot broth versus Lim broth for detection of group B Streptococcus colonization status of near-term pregnant women. J Clin Microbiol 2008; 46:2780-2. 12. 陈柔，郑仕雯，蔡文城。比较GBS-ID carrot broth、 hippurate水解与CAMP试验鉴定B群链球菌的效能。检验及品保杂志2014; 3:147-52. 13. Carvalho Mda G, Facklam R, Jackson D, Beall B, McGee L. Evaluation of three commercial broth media for pigment detection and identification of a group B Streptococcus (Streptococcus agalactiae). J Clin Microbiol 2009; 47:4161-3. 16. 郑仕雯，陈柔，沈慧珊，欧宇祥，蔡文城。评估GBS Carrot Agar 鉴别 B 群链球菌的效能。检验及品保杂 志 2014; 3:85-95. 17. 蔡文城，蔡伟勋，吕旭峰，陈诗涵，吴佩真，韩之 詅，王彦博，李秀霞。CMPTM GBS 检体运送管配合 GBS Carrot agar 的移种可提升产前检查B 群链球菌 的分离率及效率。检验及品保杂志2015; 4:51-57. 18. 黄玉霞，蔡文城。评估生殖道定植菌在CMPTM GBS 运送增菌培养管不同培养环境的消长。检验及品保 杂志2018; 7:111-18. 19. 邱彦昕，黄玉君，洪晟峰，陈诗婷，沈慧珊，蔡岳 廷，蔡文城。快速筛检B 群链球菌之简易创新设计CMPTM Group B Strep TranSwab。检验及品保杂志 2013; 2:49-59.