前言
由于B群链球菌（Group B Streptococcus, Streptococcus agalactiae, GBS，乙型链球 菌）可引起新生儿的肺炎(pneumonia)、脑膜 炎(meningitis)和败血症(sepsis)以及产妇败血 症及肺炎（图1）[1, 2]，美国疾病控制与预防 中心(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)建议怀孕35~37周之妇女需进行阴道

及/或肛门拭子的 GBS 检测，以期在分娩前 施与抗生素。此措施成功地降低新生儿GBS 感染率达75%以上，也使致死率由1970年的 50%大幅下降至1990年的5% [3]。在台湾， 卫生福利部国民健康署也为了提升产前GBS 检查的普及率，于2014年 4 月起将 GBS 检 测费纳入健保给付[4]根据美国CDC建议以及卫福部国健署委 托台湾医事检验学会拟定的侦测B 群链球菌 标准作业流程[3, 5]（图2），建议以无菌棉拭 自阴道及/或直肠采检后插入嗜氧检体运送管 (aerobic transport medium)，送到检验室后，先划种血琼脂平板(BAP)，再将棉拭插入Lim broth（纯增菌用）或carrot broth（增菌与鉴 别用），在35℃一般恒温箱培养18~24小时 后，若 BAP 上有疑似 GBS 的 -溶血型菌落 则需进行CAMP (Christie, Atkins, and MunchPetersen)、hippurate（马尿酸）水解或链球 菌分群试验加以确认，如无发现疑似菌落， 则再将 Lim broth 增菌液再次移种一血琼脂 平板，所有培养基均继续培养18~24小时， 再发出最终报告。若接种carrot broth，则检 视其是否显色，若呈胡萝卜色即可报告为GBS 阳性，若呈阴性，则再接种 GBS DetectTM （Hardy公司，美国），若有 -溶血型菌落， 则需如同Lim broth所移种BAP上的疑似菌 落进行确认试验，如无发现疑似菌落，则所 有培养基均继续培养18~24小时，再发出最 终报告。

虽然美国CDC及卫福部国健署的建议流 程可将 GBS 的检验标准化，但所用的 Lim broth增菌培养基方法需经过多次移种培养确 认，将会延迟报告3~4天[6]，而carrot broth 的接种需加一条促进产色纸条[7]，以及所建 议移种的 GBS DetectTM 伪阳性高达58% (62/107) [8]，造成检验人员的不便以及鉴定 人力与物力的浪费。由于使用嗜氧检体运送 管运送检体不能立即增菌，并可能让产道或 肠道栖息菌增生进而干扰GBS的检出。有鉴 于上述美国CDC及卫福部国健署建议方法的 诸多缺点，启新生物科技有限公司（新北市， 台湾）遂设计孕妇产前检查B 群链球菌的简 易高效快检套组，其系由运送装置 CMPTM GBS TransCultSwab（GBS 的运送增菌培养 管）[9]结合 / GBS detection agar（侦测琼 脂）[10] / GBS carrot agar（GBS 胡萝卜琼脂）[11]分隔平板(Bi-plate)而组成，此套组以 简易操作、高检出率（分离率）及可缩短报 告时间与减少检验人员操作人力做为要求。 本研究将评估 GBS TransCultSwab 结合 / GBS detection agar / GBS carrot agar分隔平 板的移种以确认其在临床实际应用的有效性。

材料与方法 :

GBS检验套组的组成 GBS 简易高效快检套组的组成包括 CMPTM GBS TransCultSwab[9]与 / GBS detection agar[10] / GBS carrot agar[11]分隔平板，每一个孕妇使用一支GBS TransCultSwab 及一个分隔平板，分别介绍如下： GBS TransCultSwab（图3A）：GBS TransCultSwab（专利证书I627277号）是一 种结合采检、运送、增菌与GBS假设性鉴定 四种功能的装置，包装中含有一支塑料管， 内含可让 GBS 增菌与实时抑制其它产道/直 肠栖息菌生长的培养基配方，以及使GBS的 -溶血株生长后显色的成份，以半固体的方式 配制以利运送；装置中另附一支无菌棉拭作 为采集产道及/或直肠分泌物检体之用。医师 采检时将棉拭取出插入产道及（或）直肠约 2~3公分处旋转两圈采取足量分泌物后插至 含增菌培养基的塑料管中，在室温或35℃恒 温箱暂时保存，然后在最短的时间内送至微 生物检验室，检验室收到此运送装置，登记 相关数据后，置于35℃的一般或 CO2 恒温 箱，培养5~24小时后可在任何时间内取出棉 拭移种至套组的分隔平板。 / GBS detection agar / GBS carrot agar 分隔平板：分隔平板中的 GBS carrot agar（专利证书I627277号）系针对GBS 溶血型菌株的侦测而设计的固体培养基，GBS carrot agar 含有特殊显色基元可让 -溶血型 GBS 的生长菌落呈胡萝卜色（图3B 的右半 边，呈米白色）， / GBS detection agar（专 利证书I561634号）系针对GBS -溶血型菌 株的侦测而设计。含有绵羊血与特殊的溶血 加强液，可让 -溶血型菌落转变成 -溶血型 （图3C的左半边，呈红色），而其接种方法 （图3 之操作流程）为取出 GBS Trans CultSwab 的棉拭划种分隔平板的两边各约 1/3，然后利用接种环操作三区划线技术，最 后在分隔平板的第一区培养基各插种5~7次， 接着放在35℃的一般或CO2恒温箱培养20~48 小时。由于其它少数菌在 / GBS detection agar 的生长菌落亦同样地呈 -溶血，因此， 培养后任何怀疑的生长菌落需再进行适当的鉴定试验（如CAMP试验、马尿酸试验或血 清分群试验）加以确认。
以临床检体实际评估GBS简易高效快检套组 从 2016年 4 月 1 日至2017年 3 月 31日 止，新北市某医事检验所以CMPTM GBSTrans CultSwab 采检744个产前 GBS 检查检体， 采集依产科门诊的作业习惯暂时保存在室温 或 35℃的一般或5 % CO 2 恒温箱，再以常温 方式运送至微生物检验室，放入35℃的一般 或 5% CO2 恒温箱培养5~24小时。若中午前 收到检体，则培养后在下班前一小时移种至 含 / GBS detection agar / GBS carrot agar 的分隔平板；若在中午后收到检体，则培养 至次日早上移种。移种的方式如上述的分隔 平板使用说明。接着，将GBS TransCultSwab 与分隔平板培养置入35℃的一般或CO2 恒温 箱培养20~48 小时，然后进行判读，若在 GBS carrot agar的生长菌落呈橘～红色，且 在 / GBS detection agar呈现 -溶血现象即 可鉴定为GBS（图3B及表1），又若在GBS carrot agar的生长菌落不呈色，但在 / GBS detection agar 呈现 -溶血现象（图3C 及表 1），则必须操作必要的鉴定试验（如CAMP 试验、马尿酸试验或血清分群试验）加以确 认。
GBS 简易、高效及快检技术所用套组与传统 检验方法的成本与效能比较 以操作100个产前GBS检查检体为例， 假设 GBS 阳性率为20%，将所评估的 GBS 简易高效快检套组与当前传统检验方法进行 成本、操作方式、效能等比较。
结果 以临床检体实际评估GBS简易高效快检套组 利用 GBS 简易高效快检套组（结合 CMPTM GBS TransCultSwab与 / GBS detection
agar / GBS carrot agar 分隔平板）在12个月 间共评估744 个临床产前检查检体，结果发 现孕妇的 GBS 检出率(阳性率)为 24.32% (181/744)，月的检出率约介于18.60%~33.33%。 （表2）
GBS 简易、高效及快检套组与公告的传统检 验方法、成本与效能比较 以操作100个产前 GBS 检查检体为例，假设GBS阳性率为20%，将GBS简易、高效 快检套组与公告的传统的 GBS 检测方法进行 成本与效能比较，传统检测方法为利用嗜氧 运送管采检及运送，送至检验室后接种血平 板或显色平板(CHROMagar StrepB)以及Lim broth或carrot broth，培养后进行判读，结果 显示 GBS 简易高效快检套组在操作时间、检 出率、报告时效、成本以及简易性等项目皆 优于公告的传统GBS检测方法。（表3）。

讨论

GBS 的孕妇带原者约为15~30%[12-17]， 医师对带原者常用的预防用药为 penicillin [3]，其施用时机为分娩前4 小时，但若孕妇 对其过敏，则检验室需提供其它适当药物的 药敏型式。又如果发生早产，羊水提早破裂， 胎儿很可能因此受到感染。因此在孕妇产前 GBS检查的正确性与快速性对预防性抗生素 的应用将具有重要性。 传统孕妇产前GBS检验方法为采检后送 至检验室立即接种BAP或其它选择区分性显 色琼脂（如CHROMagar StrepB），然而两 者 GBS 检出率不高，仅为7.5%[18]以及 9.7~11.8%[19]，且BAP 与显色平板生长菌落 对 GBS 均不具有特异性，前者为滋养培养 基，革兰氏阳性及阴性菌都可以生长，而后 者有许多其它菌如Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes (GAS)、Group G Streptococcus (GGS)、Staphylococcus aureus、 S. epidermidis与Stenotrophomonas maltophilia 的生长菌落也呈现与GBS同样的紫色菌落形态，而无法彼此区分，CHROMagar StrepB 显色琼脂的特异性仅达70% (24/40)[11]，此 发现与CHROMagar StrepB显色琼脂的使用 说明一致[20]。因此，在实际应用时，任何紫 色菌落在CHROMagar StrepB的出现还需进 行 CAMP 或 hippurate 水解等鉴定试验以确 认分离菌为GBS，此额外试验将延迟检验报 告 1 天，也更浪费人力及物力。另外，林等 [21]以 PCR DNA方法检测晚孕期阴道B 群链 球菌的定植分别发现其检出率为14.1% (288/1,472)，而杨等[22]及季等[23]应用实时萤 光定量PCR技术指出GBS的阳性率为13.5% (85/600)与 4.17% (377/9,073)。分子诊断技 术虽然快速获得检测结果，但检出率不高， 且萃取检体中的菌体DNA，不仅费时、成本 高、须有昂贵的设备与良好的实验室环境以 及胜任的操作人员，且无法实时获得进行药 敏试验所需的GBS生长菌落，美国的疾病管 制署(CDC)[3]并不建议使用分子检测方法直 接从孕妇产前检体侦测GBS。 本研究指出GBS简易、高效快检套组证 实 CMPTM GBS TransCultSwab具有采检/运送/增菌及假设性鉴定 GBS 的效能，检验人 员的使用将不需再移种增菌培养基(Lim broth 或carrot broth)，也不需如同美国Hardy生产 的carrot broth需额外插入加强显色纸条，因 此 GBS TransCultSwab的操作堪称简易、方 便与亲民(user friendly)。另外，GBS Trans CultSwab移种的分隔平板中GBS carrot agar 侦测 -溶血型GBS的特异性高达100%[11]， 因此，任何橘~红色的生长菌落可借着显色特征快速检出GBS。GBS除了 -溶血型外， 尚有3~5%属于非( )溶血型[3]，此可藉者分 隔平板的 / GBS detection agar快速侦测， 因此，检测套组对GBS的侦测是全面性的， 虽然美国Hardy Diagnostics已研发可用于侦 测 溶血型GBS的区分性培养基-GBS DetectTM （平板培养基），发现 溶血型 GBS 从孕妇 检体的检出率为3.9% (24/619)，但因其伪阳 性高达58% (62/107)[8]，将导致检验人力的浪费及伪阳性的产生，综合以上及本研究之 临床744件检体测试结果，使用 GBS Trans CultSwab搭配 / GBS detection agar / GBS carrot agar 分隔平板的移种，对GBS侦测率 （检出率）高达24.32%。（表2） 过去研究曾指出Enterococcus spp.（肠 球菌）的菌量高于 -溶血型GBS十倍时会干 扰（掩盖或抑制） -GBS在 GBS carrot agar [11]和GBS TransCultSwab的显色能力[24-26]。 推测Enterococcus spp.干扰 -GBS的原因可 能为其等同属一个菌科，生长条件相同，且 在增菌培养基的生长速度相近之故，但在相 等菌量存在时则不影响显色。目前尚无法从 配方的改变加以改善，但运送管增菌培养5 小时后，搭配 / GBS detection agar / GBS carrot agar的三区划线法移种，将可隔离GBS 与 Enterococcus spp.，而避免后者的干扰 [25]， -GBS虽然在carrot agar不显色，但可 在 / GBS detection agar产生 -溶血型菌落， 只要进行必要的 CAMP、马尿酸(hippurate) 水解或链球菌血清分群试验将可立即加以区 分[10]。 孕妇产前检查GBS分离率受到各种因素 影响[12]，包括(i) 医师或护理师的采检技术： 此因素影响GBS分离率最大，如果仅采集产 道，应该将棉拭深入产道内2 公分，慢慢旋 转 2 圈已得到最大量的分泌物为原则；如果 用同一支棉拭采检直肠部位检体，也是操作 同样的采检技术。有些医师欲分别得到产道 与直肠的检体，则共取2 支无菌棉拭采检。 (ii) 特殊增菌与分离培养基的使用：GBS 的 棉拭检体不能直接接种平板培养基，必须先 经过增菌，才能移种或操作real-time PCR。 增菌肉汤培养基包括carrot broth, Lim broth, Trans-Vag broth 以及本研究所建议的 GBS TransCultSwab，分离培养基则包括CHROMagar StrepB、BAP、CNA、PEA、GBS DetectTM以 及本研究所建议含 / GBS detection agar/ GBSCarrot agar的bi-plate，其中GBS DetectTM、 bi-plate 与 CHROMagar StrepB 均能测出 GBS，但因两者伪阳性高，因此均需要挑取 GBS怀疑菌落进一步操作确认试验（如CAMP 试验）。(iii) GBS检测的操作技术以及检验 人员的训练与经验：如果直接将棉拭检体接 种 BAP 等分离培养基或操作 PCR 等分生技 术，GBS分离率仅约7~10%左右；如果仅用 GBS TransCultSwab 的培养结果，在医师正 确采检技术及检验人员对判读有6 个月以上 经验的条件下，GBS分离率为18.63% (30/161) [9]以及18.28%[21]，如果没有足够的判读经 验，分离率约为11.03%[21]，因此，GBSTrans CultSwab 应该配合 / GBS detection agar/ GBS Carrot agar的 bi-plate的移种才能够达 到本研究所显示的高GBS分离率(24.32%)。 (iv) / GBS detection agar/ GBS Carrot agar 的bi-plate接种技术：由于是分隔培养基，因 此选用三区划线技术，移种的第一区约占表 面积的1/3，然后将接种环灭菌冷却后再涂画 第二区，同样地，再次将灭菌环灭菌后再涂 画第三区，最后在第一区插种5 次，以便获 得无氧环境，更利于 -GBS 在 bi-plate 分别 产生橘-红色[11]及产生 -溶血环。(v) 棉拭检 体需有足够的增菌时间：无论在carrot broth, Lim broth, Trans-Vag broth 以及GBS Trans CultSwab均需要培养在35~37℃的CO2 培养 箱，肉汤培养基须培养20~24小时，而GBS TransCultSwab则培养5~24小时，才能移种 至CHROMagar StrepB、BAP、CNA、PEA、 GBS DetectTM 之一的分离培养基。以及(vi) 延长培养时间及再次移种：GBS 检测的棉拭 检体经过增菌、移种及培养后如果没有显示 生长，增菌培养基最好延长培养一天，然后 再进行平板培养基的移种及培养后的观察。 总之，除了提高GBS的检出率、有能力 侦测 -溶血型 GBS 以及避免 Enterococcus spp.的干扰外，本研究亦发现此套组的分隔平板在培养隔日即可鉴定出GBS，其阳性生 长菌落可随即用于操作药敏试验，如此，将 可缩短至少一天的报告时间，并且GBS Trans CultSwab 运送管与 GBS carrot agar 上的显 色及在 / GBS detection agar呈现的 -溶血 特征将可做为三重复确认(triple-check) GBS 的存在，由于检验人员仅需移种一次，且花 费时间仅约15秒，对检验人员堪称方便，操 作人员仅需稍微训练即能进行检验工作，因 此，对临床检验室而言，GBS TransCultSwab 结合 / GBS detection agar / GBS carrot agar 的移种将具备简易、快速及高通量(highthroughput)检测的优点，值得临床检验室加 以应用，以便将阳性检验结果实时提供医师 做为预防新生儿与孕妇感染的参考。

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