摘要 卫福部食药署公告之食品微生物单核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)检验的方法中，建议 先将检体增菌后，再接种于选择性培养基（如MOX或PALCAM agar），然后将生长的疑似菌落移种至血 平板(blood agar plate, BAP)上进行 -溶血试验；而于临床检验中，则直接将检体接种至血平板上。两种检 验专业均以生长菌之溶血现象做为初步鉴别的依据，然而，李斯特菌在BAP培养后之第一天的生长菌落甚 小，且溶血现象通常微弱而不明显，操作者不易观察，而易导致漏检。有鉴于此，为了提升李斯特菌生长 菌落的溶血效果，本研究以李斯特菌标准菌株(ATCC 19111)接种至添加溶血加强剂（启新公司提供）之各 种基础培养基的血平板上，基础培养基成分分别为Trypticase soy agar（胰化酪蛋白大豆琼脂培养基，TSAII）、Columbia agar（哥伦比亚琼脂培养基)、Brucella agar（布鲁氏菌琼脂培养基）与Brain heart infusion agar（脑心浸出物琼脂培养基，BHIA）。接种后的各种血平板于35±1℃培养，分别于24及 48小时观察菌 落特征，以探讨溶血加强剂对其生长促进效能以及对菌落溶血圈直径大小的影响，结果指出，含有溶血加 强剂之各种基础培养基配制成的血平板上，李斯特菌生长能力正常，所有菌落的溶血圈环比未添加之对照 组皆有增大情形，而显现更易观察，并可缩短的判读时间 (24 h)，在食品或临床检验上，添加溶血加强剂 之血平板可降低李斯特菌之漏检或判读错误的情况发生，值得检验人员善加利用。
关键词：单核球增多性李斯特菌、溶血加强剂、 -溶血、血平板培养基

前言
单核球增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，以下简称李斯特菌），此菌于 3-45℃温度范围内可增菌[1]，而最适生长温 度为30-37℃，且可于血平板培养基上呈现 -溶血(beta-hemolysis，菌落周围呈完全溶血) 之生化特性[2]。普遍存于水、泥土等周遭环 境，亦存在于加热未完全或受污染之蔬菜、肉品及乳制品，其引起的感染症为李斯特菌 症(Listeriosis)，主要以食品作为传染途径之 媒介，患者通常会发生发烧、头痛或肠胃不 适等症状，如恶心、呕吐及腹泻等现象，也 可能引发严重并发症，例如：脑膜炎或败血 症，孕妇、婴儿、年长者、或免疫力较弱的 人受感染的风险较高[3]。且李斯特菌症已于 2018年 1 月 1 日被卫生福利部疾病管制署列 为「传染病防治法」规定之第四类传染病[4]。 根据吾等统计2018年 1-8月引发全球主要食 安事件的病原菌，依食安事件数的比例显示 李斯特菌仅略少于沙门氏菌，位居第二（表 1）[5-6]，由此可见其对于食品安全之重要性

由于李斯特菌在平板上生长之菌落直径 较小、溶血圈较不明显而不易观察。根据卫 生福利部食品药物管理署公告之检验方法， 李斯特菌初步鉴定之 -溶血试验 ( -hemolysis test) 为将食品检体先接种至选择性培养基 如：MOX（改良式牛津培养基，Modified Oxford medium）、PALCAM（帕尔康李斯 特菌选择性培养基，PALCAM Listeria Selective agar）或显色性培养基 (CHROMagar) 后， 再将怀疑为李斯特菌之菌落移种至含绵羊血 之血平板并培养48小时，然而，一般李斯特 菌菌落将呈微弱溶血现象[7]，而降低其判读 结果的准确性，将影响李斯特菌从食品中分 离的阳性率[8]；另外，于临床检体的李斯特 氏菌检验中，将检体（如脑脊髓液、产道分 泌物等）直接接种至血平板上，根据菌落的 溶血现象，再进一步纯化及鉴定，若溶血现 象不明显，将使操作者观察困难，而导致漏 检。 卫福部公告之食品微生物检验方法[7]与 中华人民共和国国家标准[9]，对于李斯特菌 的溶血试验皆建议接种怀疑菌落至以TSA-II （胰蛋白酶大豆琼脂培养基，Trypticase soy agar-II）配制含5% 绵羊血的血平板，培养 48小时，再以判读溶血情形；而临床李斯特 菌检验中，多使用以含 TSA-II 或 Columbia agar（哥伦比亚琼脂）基础培养基所配制的 血平板。 为了促进李斯特菌之 -溶血情形于血液 平板上更加明显，本研究以TSA-II、Columbia agar、Brucella agar（布鲁氏菌琼脂培养基） 及 BHIA（脑心浸出物琼脂培养基，Brain heart infusion agar）作为不同基础培养基之 血平板并添加溶血加强剂（Hemolysis enhancer，启新生技公司研发与提供），接种测 试的李斯特菌于上述几种血平板中，培养后 进行李斯特菌之溶血环大小及判读清晰度比 较。研究中所使用之溶血加强剂曾应用于CMPTM / GBS detection agar（启新生物科 技有限公司，台湾）中，可诱导B 群链球菌 （GBS，乙型链球菌，Streptococcusagalatiae） 的 -溶血型变成为 -溶血型，而不影响其他 测试菌的溶血型式及菌落之外观，该研究同 时指出溶血加强剂并不会改变李斯特菌之溶 血形态，使其仍维持 -溶血型[10]。有鉴于此， 本研究结果将观察含溶血加强剂的血平板对 李斯特菌菌落之 -溶血环大小的影响。
表 1. 2018年 1-8月引发全球主要食安事件 的病原菌统计
污染菌名称 食安事件数 比例 沙门氏菌 48 37.5% 李斯特菌 39 30.5% 产毒性大肠杆菌 24 18.8% 肉毒杆菌 7 5.5% 阪崎肠杆菌 1 0.8% 仙人掌杆菌 1 0.8% A 型肝炎 3 2.3% 诺罗病毒 2 1.6% 未指出菌名 3 2.3% 总数 128 100%
材料方法
菌株制备 本研究使用Listeria monocytogenes ATCC 19111 作为培养基效能评估的菌株，此菌保 存于-70℃冷冻库，测试前移种至 BAP （血 平板，blood agar plate，启新生物科技有限 公司，新北市），培养于35±1℃ CO2培养箱 中 22~24小时后，再接种至另一BAP进行第 二次活化。
菌液之制备 欲取得适当菌量之李斯特菌菌液以涂抹 于培养基上，故先以接种环钩取BAP上已活 化之李斯特菌菌落至5 mL TSBYE（胰化酪
蛋白大豆酵母抽出物培养液，Trypticase soy broth with 0.6% yeast extract）中，调菌液 至相当于McFarland No. 0.5的标准浓度（约 1.5×108 CFU/mL），利用分光亮度计测其 O.D.值为0.089，再使用微量吸管吸取0.5 mL 此菌液加入至4.5 mL TSBYE中作十倍稀释， 序列稀释五次后，采用最后一管稀释液进行 各个培养基的效能评估。
培养基 效能评估使用的不同基础培养基包括： (i) TSA-II、(ii) Columbia agar、(iii) Brucella agar 及 (iv) BHIA，有关其等之组成分列于 表 2；以此四种基础培养基（均购自 BD 公司）配制成含5% 绵羊血之BAP（由启新生 技公司配制）作为对照组，另外将上述各种 BAP额外添加相同浓度之溶血加强剂（启新 生技公司提供）作为试验组。
培养基之生长及 -溶血效能评估 操作步骤：将上述制备完成之菌液，以 微量吸管分别吸取0.05、0.1、0.15与 0.2mL 至各个试验组与对照组之血平板中，再使用 无菌三角玻棒均匀涂抹平板表面，此实验重 复操作二次，每次接种的血平板为两个，接 着将所有平板倒置，培养于35±1℃培养箱中 24~48小时后，观察各个培养基上的菌落生 长情形，并且量测菌落之溶血圈直径(mm)，最终选择50~250 CFU 菌量培养基之平板进 行计数。
溶血圈大小量测：利用带表卡尺（太一 电子检测有限公司，新北市）量测经培养24 及 48小时后之各个平板上的菌落溶血圈直 径，判读时将培养皿底部正对光源，随机采 取10个独立分离菌落，观察量测透明之溶血 圈直径大小并取得平均值(mm)，最后再进行 比较试验组与对照组之差异。比较方式为将 试验组中以TSA-II为基础培养基所配制的血 平板上菌落溶血环之大小作为基准(100%) 进 行计算，公式为：（含有各种基础培养基的 血平板上菌落溶血圈之直径平均值/ 含 TSAII 基础培养基之试验组血平板上菌落溶血圈 之直径平均值）×100%。
结果 单核球增多性李斯特菌在含有溶血加强 剂之TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 及 BHIA 基础培养基所配制成的试验组血平 板与未添加溶血加强剂的对照组血平板上， 分别接种浓度约1.5×103 CFU/mL李斯特菌 菌液，分别取0.05、0.1、0.15及 0.2 mL 的 量至各个试验组与对照组之血平板培养基中 进行涂抹法，此实验重复操作二次，每次接 种的血平板为两个，经35±1℃培养24~48小 时后，以获得菌数落在50~250 CFU 范围之 平板进行计数及量测溶血圈大小，结果纪录 于表3。添加于未添加溶血加强剂血平板的 菌落数均落在30%以内，显示细菌之生长效 能均为相同。 各个血平板上之李斯特菌菌落溶血圈的 直径大小列于表4，比较含各基础培养基之 血平板上的菌落之形状与颜色，试验组与对 照组并无明显差异，当培养24小时后的菌落 显示为小型、边缘完整、透明凸面且呈小圆 形，当继续培养至48小时，菌落增大且变得 不透明，颜色呈灰白色。含有溶血加强剂的试验组血平板中，与 未添加溶血加强剂之对照组血平板相比，不 论观察时间为24或 48小时，试验组的菌落 生长比对照组的溶血圈更扩散。（图1）在 培养24小时后，含有溶血加强剂之试验组血 平板菌落显示明显的溶血圈，而在培养48小 时后，含有溶血加强剂的试验组血平板上， 菌落的溶血圈直径皆更增大至约4 mm，甚 为清晰而易于观察。

讨论
本研究使用的四种基础培养基之试验组 与对照组血平板上，各接种适当浓度之菌液 0.05、0.1、0.15及 0.2 mL 进行涂抹法并操 作两次，每次接种两个血平板后，相同取量 的菌液在各种相同基础培养基之试验组与对 照组血平板上所生长之菌落数目无明显差异 （表3），皆落在合理的误差范围 (30%) 内 [13-14]。由此可知，溶血加强剂对于各种基础 培养基之血平板并无抑制或促进菌落生长的 情形。 根据研究结果（表4）指出，以TSA-II、 Columbia agar、Brucella agar及 BHIA作为 基础培养基之血平板，接种适当浓度菌液并 培养24小时后，未添加溶血加强剂的对照组 血平板上，菌落溶血圈不明显而不易观察， 直至培养48小时后，才可稍微清楚看到溶血 圈；然而，添加溶血加强剂的各基础培养基 之试验组血平板中，溶血现象明显，相较于 对照组，其溶血圈环皆有增大情形，直径皆 约为4 mm，就算不正对光源观察，肉眼也 清楚可见，可使操作者更方便且正确观察， 并可于较短的培养时间(24小时)内更清楚明 显地判读其溶血情形，有利于操作者观察李 斯特菌菌落的溶血现象，在食品或临床检验 上，可降低漏检或判读错误的情况发生。 综合上述结果，溶血加强剂添加于以 TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 及BHIA 作为基础培养基之血平板中，均可促 进李斯特菌之 -溶血，使得溶血圈直径增大， 且此溶血加强剂不会影响(抑制或促进)平板 上菌落的生长。因此，溶血加强剂对于食品 中分离的李斯特菌在血平板上进行溶血试验 初步鉴定时，可更清楚明显地辨识溶血情形， 而可协助鉴别李斯特菌的检出，并且可缩短 一天的检验时间。同样地，亦可协助临床检体之李斯特菌的分离，值得检验人员善加利 用。此溶血加强剂在未来或许也可以应用于 协助鉴定其它各种临床病原菌如 Propionibacterium acnes、Actinomyces neuii subsp. anitratus、Corynebacterium auris、Corynebacterium bovis、Corynebacterium coylae 及 Corynebacterium glyucuronolyticum[15]， 但须进一步评估。
参考文献
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