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摘要
大肠杆菌群(coliform)多存在于温血动物之粪便、人类活动之场所及有粪便污染的地方，常被作为食品 被粪便污染之指标。近年来，ISO 机构提出以肠杆菌科倾注平板检验方法取代大部分食品的大肠杆菌群MPN 法作为卫生指标菌，而台湾卫福部食品药物管理署亦于 2018 年 8 月公告肠杆菌科检验方法之草案。 为了评估新公告之草案与其它两种大肠杆菌群检验方法(台湾之大肠杆菌群 MPN 法及中国大陆国标大肠 杆菌群直接平板法)之效能，本研究利用 15 件手摇饮料检体及 2 件标准菌种的对照组进行三种方法检验结 果的比较。利用不同稀释浓度的检液及培养基等进行评估，培养 24 小时后，计数及接续进一步鉴定。结果 发现其中有5个检体为未检出和2件阳性饮料检体MPN法超过1,100 MPN/g，因此，不能作为比较之用， 本研究以介于未检出及大量检出中间的 8 件阳性检体进行生长的菌数多寡比较，结果指出以新公告肠杆菌 科草案所获得的肠杆菌科菌数比其它两种大肠杆菌群方法所获得的菌数高，此说明卫福部新公告方法作为 卫生指标菌有其意义及重要性。另外，本研究发现市售手摇饮料大肠杆菌群或肠杆菌科卫生指标菌检测不 合格率高达66.7% (10/15)，值得卫生主管单位作为稽核及加强从业人员卫生教育的参考。
关键词:肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、大肠杆菌群、MPN 法、卫生指标菌
前言
肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是指在适 当条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需 氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。细菌 学上将肠杆菌科的细菌分为 20 个菌属，包括Escherichia(埃希氏菌)、Shigella(志贺氏 菌)、Salmonella(沙门氏菌)、Citrobacter(柠檬酸杆菌)、Klebsiella(克雷伯氏菌)、Enterobacter(肠杆菌)、Serratia(沙雷氏
菌)、Hafnia(哈夫尼氏菌)、Edwardsiella(爱德华氏菌)、Providencia(普罗威登斯 氏菌)、Proteus(变形杆菌)、Morganella(摩根氏菌)、Yersinia(耶尔森氏菌)等[1]。
大肠杆菌群(coliform)并非指特定菌株， 而是指一群在人体肠胃道内有相同生理活性 的菌群。在细菌学上的意义为一群好氧或兼 性厌氧且能在 37°C下分解乳糖产酸产气的革 兰氏阴性无芽孢杆菌，主要包括柠檬酸杆菌(Citrobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、肠 杆菌(Enterobacter)、大肠杆菌(Escherichiacoli);但不包括非乳糖发酵型的食品病原菌 (例如:沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌 等)，因此不够明确表示出食品加工后的卫 生状况[1]。
长久以来，食品卫生中以指标菌作为食 品安全及质量的标准。当无法检测食品中每 种有害微生物时，只针对某些特定指标菌作 为是否合乎卫生要求之指标，如:总生菌数、 大肠杆菌群、大肠杆菌。目前台湾检验大肠 杆菌群使用的 MPN 法只是估计值，并不是很 精确，且大肠杆菌群只能检测乳糖发酵型食 品病原菌。
2018 年 8 月卫福部提出肠杆菌科的检验 方法草案，因为肠杆菌科包括所有能够发酵 葡萄糖产酸、氧化酶阴性的革兰氏阴性无芽 孢杆菌，涵盖的种类较大肠杆菌群为多，也 包括了病原菌，除了大肠杆菌群的乳糖发酵 型细菌，还包含许多非乳糖发酵型细菌(如 变形杆菌及其它相近菌种)，能够确切呈现 较实际的污染程度[1]。
本研究主要目的是将台湾肠杆菌科直接 平板检验方法草案与大肠杆菌群 MPN 法、大 陆国标大肠杆菌群直接平板检验方法做比较， 想了解市售饮料中大肠杆菌群及肠杆菌科的 侦测以不同方法及培养基进行，产生之数据 会有何差异。
材料及方法
试验材料
本研究主要是初步评估 2018 年 8 月 1 号卫 生局福利部食品药物管理署订定之肠杆菌科 检验方法草案与原先公告的大肠杆菌群 MPN法、大陆国标大肠杆菌群检验方法这三者的 效能差异，共检测 15 件检体，均为手摇饮料。
试剂与耗材
根据台湾公告大肠杆菌群 MPN 法、肠杆菌科直接平板检验、大陆国标大肠杆菌群直 接平板检验所需的稀释液(磷酸缓冲溶液、 缓冲蛋白胨水)、选择性增菌液(Lauryl sulfate tryptose broth、brilliant green lactose bile broth)、选择性分离培养基(VRBGA、VRBA)及滋养培养基(Blood agar plate，BAP)皆购 自启新生物科技有限公司(新北市，台湾)。 培养基均经无菌性试验与培养基效能(即滋 养性、增菌性、选择性与区分性相关效能) 试验确认质量。
菌株制备
本研究的品管对照菌株为 Enterobacter cloacae ATCC 13047 及 Escherichia coliATCC 25922 作为培养基效能测试的对照组 菌种，将两菌株接种至 BAP 培养于 35±1°C 一般培养箱中 18~24 小时，之后接种第二次 达到生化/生理特性的活化效果。
菌液制备
将欲得到预估菌量的菌液滴至无菌培养 皿进行倾注平板法作为基准，首先以接种环 挑取活化后之菌株于 0.85%之 5 mL TSB 中 调整菌液浓度至相当 McFarland no. 0.5 标准 液，以分光亮度计测量 Enterobacter cloacae及 Escherichia coli 之 OD 值分别为 0.082 及0.088，再从菌液使用吸管取 1 mL 菌液加入9 mL 灭菌饮料进行序列稀释至 106 倍，随后 进行效能比较试验。
台湾公告之大肠杆菌群 MPN 法[2]:此方 法是检体经序列稀释后，以三阶三管进行培 养，并进行 MPN 计数。操作时，秤取 50 g饮料检体加入 450 mL 磷酸缓冲溶液(Phosphate buffer，pH 7.2)，即为 10 倍稀释液。再以 90 mL 磷酸缓冲溶液进行 10 倍序列稀释后，分 别吸取 1 mL 稀释液(1:10，1:100 及 1:1,000)注入装有发酵管的 Lauryl sulfate tryptose broth (LST)各三支，在 35°C一般培养箱培养24~48 小时后，若发酵管内有气体产生则为 大肠杆菌群推定阳性。自阳性试管内取一接 种环液体至 brilliant green lactose bile broth (BGLB)，在 35°C一般培养箱培养 24~48 小 时后，产气者为大肠杆菌群阳性，计算 BGLB阳性反应试管数，查 MPN 表，最后计算大肠 杆菌群之最确数，以 MPN/g 表示。
台湾公告肠杆菌科直接平板检验法[3]: 检体经系列稀释后，以倾注选择性平板培养 基培养及计数之方法。秤取 50 g 饮料检体加 入 450 mL 缓冲蛋白胨水(BPW)，即为 10 倍 稀释液。再以 90 mL 缓冲蛋白胨水进行 10 倍 序列稀释后。取 1 mL 稀释检液至无菌培养 皿，二重复，再倒入 10~15 mL 的 violet red bile glucose agar (VRBGA)，以 8 字方式摇 匀，将培养基与检液充分混匀，待培养基凝 固后，再加 3~4 mL VRBGA 覆盖平板表层， 防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。然后 将凝固后的平板置于 37°C一般培养箱，倒置 培养 24±2 小时后，计数平板上菌数量(计数 介于 15~150 菌落数)。典型菌落为有或无沉 淀环的粉红色至红色或紫色菌落。从 VRBGA平板上至少挑取 5 个(少于 5 个全选)典型 菌落进行确认。其方式为分别将所挑选的每 一个菌落，四区划线于 BAP，置于 37°C一般 培养箱，倒置培养 24±2 小时后，挑取单一菌 落进行 MALDI-TOF MS 的鉴定。
大陆国标大肠杆菌群直接平板检验法[4]: 检体经系列稀释后，以倾注选择性平板培养 基培养及计数之方法。取 50 g 饮料检体，其 无菌稀释液及稀释方法与台湾 MPN 法相同。 取 1 mL 稀释检液至无菌培养皿，二重复， 再 倒 入 15~20 mL 的 violet red bile agar (VRBA)，8 字摇匀，将培养基与检液充分混 匀，待培养基凝固后，再加 3~4 mL VRBA覆盖平板表层。然后将凝固后的平板置于36±1°C一般培养箱，倒置培养 18~24 小时 后，计数平板上菌数量(计数介于 15~150 菌落数)。典型菌落为紫红色，菌落周围有红 色胆盐沉淀环，菌落直径为 0.5 mm 或更大。 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型 和可疑菌落，少于 10 个菌落时，则挑取全部 典型和可疑菌落。分别移种于 BGLB，在36±1°C的一般培养箱培养 24~48 小时后，产 气者为大肠杆菌群阳性。
MALDI-TOF MS 鉴定肠杆菌科[5]
选取 MSP 96 凹槽靶板(96-wells
target
plate)的一个凹槽滴加 Bruker 细菌测试标准(bacterial test standard)， 风 干 后 即 可 进 行Microflex LT 仪器校正，然后分别以灭菌牙 签挑取适量的预检测菌落到 MSP 96 靶板的 各个测试凹槽上，待干燥，将测试凹槽以 1
L 的 70% formic acid(甲酸)(Sigma, USA)覆盖后，干燥，最后滴加 1 SHAPE \* MERGEFORMAT
L 的标准溶液 SHAPE \* MERGEFORMAT
结果
检测 15 件饮料检体及两组对照组进行台 湾公告大肠杆菌群 MPN 法、肠杆菌科直接平 板检验方法与大陆国标大肠杆菌群直接平板 检验方法后，若呈阳性，则取 15-150 CFU 计 数范围内之培养基进行计数(图 1)，并分 别取 5 个或 10 个可疑菌落进行纯化，再进行MALDI-TOF MS确证，最后代入公式计算。15 件检体中扣除三种方法均未检出的 5件检体以及 2 件 MPN 法超过 1,100 MPN/g,因此，不能作为比较之用，本研究以介于未 检出及大量检出中间的 8 件阳性检体进行 3种方法测试结果的比较，结果如表 1。又本 研究另外发现手摇饮料以三种方法检验之卫
生不合格率均高达 66.7%(10/15)
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讨论
检体的成分不同，可能会影响方法之效 能，因此需要额外做一组对照组。标准菌株 之预估菌量为 1.5×108 CFU/mL，在三种方 法下检测到的菌量皆约为 107 CFU/mL，由 此可看出无明显差异，而 MPN 法中无法得到 准确菌数。本研究所使用的检体 11~15 皆无 阳性产气管及菌落生长，因此取无菌之饮料后作为调菌基质，进行对照组之确认。检体1、检体 3、检体 4 及检体 8 在大陆国标大肠 杆菌群、台湾肠杆菌科之方法中菌数皆落在102 CFU/g，但在 MPN 法只侦测到 43 MPN/g(95%信赖区间为 9~180 CFU)，由此可看 出 MPN 法检出的菌数比其他两种方法低。另 外，检体 2、检体 5、检体 6 及检体 7 之检出 菌数以台湾肠杆菌科方法最高，其次为大陆 国标大肠杆菌群，而以 MPN 法最低。
台湾肠杆菌科检验方法侦测之菌数最多， 是因肠杆菌科包含 42 个菌属，涵盖范围大， 其中就包含卫生指标菌及常见病原菌，例如 大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆 菌等。此方法中所使用的 VRBGA(结晶紫 中性红胆盐葡萄糖琼脂)组成分中含有乳糖 和葡萄糖，因此，VRBGA 适用于所有肠杆 菌科菌种的分离。大陆大肠杆菌群检验方法 所使用的 VRBA(结晶紫中性红胆盐琼脂) 与 VRBGA 之组成分有些微差异，VRBA 仅 含有乳糖，适用于乳糖发酵型细菌的分离。 因此此方法能侦测到之菌数会比肠杆菌科还 要少。
最后，MPN 法属于半定量法，透过大肠 杆菌群之生理功能判断此菌的存在及数量， 判读后，查 MPN 表，推算出来的数据仅为统 计估计值，有其信赖区间，但无法得到准确 之数据。若要以 MPN 法与直接平板法做比 较，以直接平板法所获得的菌数较高，且在24 小时内可获得结果。
根据 MALDI-TOF MS 确证之结果，发 现VRBA中可生长之菌种包含Rahnella aqua- tilis、Pantoea agglomerans、Enterobacter asburiae、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumoniae、Serratia plymuthica、Erwinia persicina、Ewingella americana、Bacillus clausii，其中 Bacillus clausii 属于芽孢杆菌 科，主要是因为其可利用乳糖发酵产生乳酸， 因此可在 VRBA 生长。而 VRBGA 除了上述 菌种以外，还鉴定出葡萄糖非发酵菌中的Achromobacter xylosoxidans，此可能是因为 此菌可氧化利用葡萄糖之故。由此可知，VRBA 及 VRBGA 除了大肠杆菌群及肠杆菌 科可生长外，也可能会有其他菌种生长。
中国国标中肠杆菌科检验方法可分成MPN 法及倾注平板法，ISO 另外公告食品之 肠杆菌科检验法以直接平板法取代 MPN 法 后，许多国家随后跟进订定相关公告方法，台湾于 2018 年 8 月也提出草案。各国皆以直 接平板法为主要之食品卫生指标菌，但可能 是因为 MPN 法过程繁琐，从采样至最终报告 所需时间较长，因此台湾之肠杆菌科检验方 法仅公告直接平板法，而没有 MPN 法。
本研究发现手摇饮料以三种卫生指标菌 检测方法检验的结果，卫生不合格率高达66.7%(10/15)，然而，其中 60%(6/10) 的大肠杆菌群菌数低于 100 MPN/g(mL)，若 以 Petrifilm E. coli/coliform count plate 检 测，将仅能检测 22.7%[6]。
综合上述结果，15 件检体中以台湾卫福 部公告肠杆菌科的直接平板法效能最佳(获 得菌数最高)，因为培养基之成分可供较多 革兰氏阴性菌、葡萄糖发酵型细菌生长，而 大陆国标大肠杆菌群之直接平板法所使用的 培养基成分仅限于乳糖发酵菌的生长，因此 生长的菌种较少，最后 MPN 法若是大肠杆菌 群菌量过多的情况下，将无法准确得知其菌 量。
参考文献
